在中国免疫及靶向治疗高峰论坛暨高博第三届淋巴瘤&骨髓瘤国际高峰论坛上，高博医学（血液病）北京研究中心北京博仁医院刘英主任分享了题为“异基因双靶点CAR-T细胞序贯治疗1例移植后复发儿童B细胞淋巴瘤”的精彩报告，和与会专家分享凶险难治病例的诊治经验。

起病凶险，一线化疗达CR

基本信息：

• 4岁女孩，以纵膈巨大瘤灶于2019年2月起病；

• 肿瘤侵犯部位包括双锁骨上窝及腋窝淋巴结、纵膈巨大瘤灶(10cm×6cm×9.3cm)、左侧胸膜及胸背部软组织、腹主动脉左旁(2.1cm×2.5cm×5.1cm)、T1-4、9-10椎管、脑脊液和骨髓。

图1 患儿PET-CT检查

骨髓检查：

• 骨髓形态示原幼淋占87%；骨髓流式免疫分型和病理免疫组化均示异常增殖的细胞为恶性B细胞，但就恶性B细胞的分化阶段，免疫分型和免疫组化不全相同；流式示幼稚B细胞标志CD99阳性，考虑B淋母；病理免疫组化示幼稚B细胞标记CD99和TdT均阴性，成熟B细胞标记也没有阳性，倾向B淋母。

• 骨髓的分子异常有MLL/AF9阳性， KRAS基因突变，分子层面上支持B淋母诊断。

• 脑脊液流式示1.66%恶性幼稚B淋巴细胞。

诊断：

• 骨髓MICM整合诊断B淋巴母细胞淋巴瘤（白血病期CNS3高危组）。

一线治疗过程：

• 按照CNCL-2017-LBL高危组方案顺序完成VDLP+CAM×2+HR-1+HR-2+HR-3+ HR-1化疗。

• 中期评估骨髓和脑脊液微小残留病灶（MRD）均阴性，PET-CT示前纵膈瘤灶(4.0cm×2.2cm×3.5cm)缩小94.5%，残余少许肿瘤活性；3疗程巩固化疗后前纵膈瘤灶(1.9cm×2cm×2cm)较中期进一步缩小75%；4疗程巩固化疗后前纵膈瘤灶与前疗程相比大小无明显变化，其内可见钙化，考虑结构残迹。患儿达完全缓解（CR），于 2019年9月行同胞半相合造血干细胞移植。

移植后仅隔9个月复发，后续治疗何去何从？

患儿于移植后3个月PET-CT示前纵隔肿物完全消失，于移植后9月(2020-07-01) PET-CT发现新发瘤灶，分别位于左侧胸壁软组织(4.3cm×1.3cm×3.7cm)、双侧附件(左1.4cm×2.3cm×2.4cm，右4.0cm×3.4cm×4.1cm)及左侧肱骨中下段。

新发肿瘤组织的免疫组化示幼稚B细胞标记TDT(-)和CD99(少量+)，倾向高级别B细胞淋巴瘤，NGS也检测到新的CARD11 基因突变，而初诊时的KRAS突变未检测到。尽管免疫表型和分子特征有一些改变，但肿瘤细胞的MLL/AF9基因仍阳性，故考虑原发病复发，诊断B淋巴母细胞淋巴瘤复发伴部分成熟B细胞转化(III期 CNS1)。

复发后，挽救治疗仍然进展

患儿于2020年7月至2020年9月在外院先后接受了供者淋巴细胞回输(DLI)、供者mCD19CAR-T细胞回输、供者hCD22CAR-T细胞回输和二次DLI，左侧卵巢肿物消失，而右侧卵巢肿物持续增大至6.2cm×5.2cm×5.0cm，卵巢肿物2次活检免疫表型仍示成熟B细胞表型，且于二次DLI回输后1周开始先后出现皮肤和肺的移植物抗宿主病(GVHD）。

多学科联合会诊，联合靶向治疗为后续CAR-T治疗保驾护航

患儿为进一步治疗转入我院。入我院后先采集并冻存了患者的外周血单个核细胞，以备后续CAR-T治疗。

患儿虽然发生了GVHD，但复发瘤灶并没有因为GVHD的出现而缩小或消失，依然持续增大，所以我们在治疗GVHD同时给予挽救性化疗。考虑卵巢肿物倾向成熟B细胞表型，我们选择成熟B细胞淋巴瘤的化疗方案。先用了两个疗程M2方案的化疗，左前胸壁肿物逐渐缩小；右卵巢肿物有部分反应，但化疗间歇期会有反复。故在肺GVHD治疗6周CT示右肺小气道陷闭程度明显减轻后，我们对患儿进行了多学科联合会诊，讨论再次行CAR-T治疗的可行性。

呼吸科张波主任认为：既然儿童闭塞性细支气管炎(BO）已经排除，再次CAR-T治疗有肺GVHD加重的风险，但不是绝对禁忌症；

移植科吴彤主任认为：根据既往经验，移植后合并内脏排异患儿再次给予CAR-T免疫治疗，因CAR-T后细胞因子风暴（CRS）导致内脏衰竭的风险高，不建议该患儿继续给予CAR-T治疗，可以考虑Blinatumomab双特异性抗体治疗，虽存在CRS风险，但此CRS比CAR-T后CRS轻，还可联合应用靶向药物BCL-2抑制剂和伊布替尼，伊布替尼可适当减轻GVHD症状。

分子检测实验室郑勤龙主任认为：加用伊布替尼靶向治疗，不仅可以减轻GVHD症状，还针对BCR通路上的CARD11 p.T532M基因变异。

我们根据会诊意见给予患儿Bite +伊布替尼+维奈托克联合靶向治疗，2周后右侧卵巢肿瘤增大，即停Bite，继续伊布替尼+维奈托克，同时给予CYVE化疗，肿瘤明显缩小。

异基因双靶点CAR-T序贯治疗带来全新希望

2020年1月20日肺GVHD治疗10周，CT示双肺透亮度恢复正常，提示患儿具备了再次行CAR-T治疗的条件；卵巢肿物第3次活检：组织流式免疫分型显示CD19和 CD22强表达，NGS未检测到CD19和CD22基因发生明确影响CD19CAR和CD22CAR结合的变异，提示虽然之前已做过CD19和CD22的CAR-T治疗，CD19和CD22仍可作为CAR-T治疗的靶点。基于此，建议患者入组博仁医院开展的CAR-T治疗临床研究。为避免外院CAR-T治疗后可能产生的抗体，我们先用人源CD19CAR，再序贯全人源CD19&CD22双靶点CAR；采用移植后HLA完全嵌合的受者外周血单个核细胞培养CAR-T细胞，这种异基因自体T细胞既有正常的T细胞功能，又在受者体内经历驯化，可降低GVHD的风险。

图2 异基因双靶点CAR-T序贯治疗过程

此患儿的CAR-T治疗不仅克服了肺GVHD的屏障，还利用CAR-T治疗新技术，包括供体CAR、双靶点CAR和序贯CAR-T以延长CAR-T细胞在体内的扩增时间，诱导持久的完全反应。

温故知新，集结CAR-T新技术，进一步积累临床实践经验

本病例属于高危B淋巴母细胞淋巴瘤/白血病，异基因造血干细胞移植后复发，且部分向成熟B细胞转化，传统DLI和挽救性化疗的效果有限。对于难治复发B细胞淋巴瘤，不论幼稚B还是成熟B，都可以考虑免疫靶向治疗，用于B细胞淋巴瘤的免疫靶向药包括BTK抑制剂、mTOR抑制剂、PIK3抑制剂、CD79b和CD19的抗体偶联药物、CD19和CD3双特异性抗体、CD19靶向CAR-T 等。

此患儿采取BTK抑制剂+Bcl2抑制剂+BiTE联合方案，以期达到免疫抗肿瘤同时减轻GVHD风险，但并未在短时间内控制肿瘤进展，患儿最终还是通过CAR-T治疗获得了CR。

我们用CAR-T治疗此例患者的目标不仅是为了获得CR，还要达到持久的CR甚至治愈。但是，单靶点CD19 CAR-T的长期疗效不如人意，治疗难治复发弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的长期缓解率35%~40%，治疗B-ALL的1年无事件生存率（EFS）不足50%。

而CD19 CAR-T难以维持长期缓解的原因，一是CD19阴性复发，为CD19抗原表达的丢失或下调导致；另一种发生率更高的是CD19阳性复发，为CAR-T细胞在体内有限的生存时间及功能的耗竭所致。影响因素包括：采集T细胞的数量、质量和亚群，CAR的设计、转染和体外CAR-T细胞的增殖、回输前的肿瘤负荷、预化疗以及回输后的信号传导通路和肿瘤微环境等。

为了达到我们的治疗目标，我们在T细胞收集环节采用移植后HLA完全嵌合的自体T细胞制备CAR-T细胞以提高CAR-T细胞功能；在CAR设计环节，我们采用双抗原靶向CAR-T细胞克服抗原阴性复发；并用不同靶点CAR-T的序贯策略以延长CAR-T细胞在患者体内存在的时间。

异基因CAR-T细胞治疗移植后B细胞淋巴瘤

7个临床研究72例移植后复发B细胞肿瘤患者接受异基因CAR-T细胞治疗的疗效和安全性的Meta分析如下：

• 异基因CAR-T细胞种类：异基因供者CAR-T或异基因自体 CAR-T，其T细胞的功能强于移植前自体T细胞的功能；

• 异基因CAR-T细胞回输的窗口时间：移植后55-200天；

• 异基因CAR-T细胞回输剂量：0.4×106 –5×108 CAR-T cells/kg；

• 异基因CAR-T细胞适应证：移植后B细胞肿瘤的复发预防、MRD清除和复发后挽救治疗；

• 客观缓解率（ORR）达90%以上；

• 严重CRS及神经毒性发生率低；

• 仅5例（6.9%）发生GVHD。

图3 Meta分析结果

双靶点CAR-T细胞治疗难治复发B细胞淋巴瘤

韩卫东教授关于CD19/CD20双靶点CAR-T的基础和临床研究结果显示：双靶点CAR-T细胞相比单靶点CAR-T细胞，具有较强的细胞毒杀伤功能，而分泌细胞因子较少，相应CRS反应较轻，在体内的耗竭减少，反应持续时间相对较长，治疗28例难治复发B细胞淋巴瘤患者的1年无进展生存率（PFS）提高至64%。

CAR-T细胞序贯治疗儿童难治复发成熟B细胞淋巴瘤

张永红教授领导的北京博仁医院儿童淋巴瘤科进行了不同B细胞靶点序贯治疗难治复发儿童B细胞淋巴瘤的I、II期临床研究和双靶点CAR-T治疗难治复发儿童B细胞淋巴瘤的I期临床研究。对入组I期的23例伯基特淋巴瘤患者进行了长期随访，截止至今年3月份，中位随访时间17个月。最初5例患者的短期疗效报道已在BLOOD发表，总结长期疗效的文章已被Blood Advances接收。

通过不同B细胞靶点CAR-T细胞序贯来延长CAR-T细胞作用时间的关键在于序贯时机。如果序贯早了，可能会提前终止前一靶点CAR-T细胞的作用，如果序贯晚了，肿瘤可能会在下一靶点CAR-T细胞回输前进展或复发。所以我们根据CAR-T疗效评估结果和外周血CAR-T细胞数共同决定序贯时机：待CRS反应基本消失、外周血细胞恢复至安全水平时，流式检测不到CAR-T细胞而PCR方法仍能检测到CAR-T细胞时瘤灶仍有残留者以及达CR2需巩固治疗者或者流式仍能检测到CAR-T细胞而瘤灶进展以及出现新发瘤灶者，可考虑进行下一个B细胞靶点的序贯。

入组I期临床的23例患者中，21例在最后1次CAR-T回输后获得CR，18例（86%）在最后1次CAR-T回输后至1年半仍能维持CR。截止至今年3月份，最长持续缓解时间是34个月，23例患者预期1年半PFS 为78%，其中巨大瘤灶组78%，中枢受累者60%。23例患者中8例发生III级CRS，5例发生III级中枢毒性，所有不良事件均可控可复；中枢受累组与非中枢受累组的严重中枢毒性无显著差异。

我们的研究结果显示：序贯CAR-T治疗可以在难治复发B细胞淋巴瘤患者体内诱导持久的完全反应，合并巨大瘤灶或中枢受累的难治复发B细胞淋巴瘤患儿可以从序贯CAR-T治疗中获益。

病例总结

• B淋巴母细胞淋巴瘤/白血病在化疗和移植的压力选择下可以向成熟B细胞转化；

• DLI和挽救化疗对异基因移植后复发的B细胞肿瘤疗效有限；

• Bite难以在短时间内控制B细胞淋巴瘤的进展；

• CAR-T细胞兼有DLI和Bite的双重功效，可兼治幼稚B细胞淋巴瘤和成熟B细胞淋巴瘤，且异基因自体CAR-T相比DLI有更高的安全性；

• 从单靶点CAR-T到双靶点CAR-T以致多靶点CAR-T的序贯，从自体CAR-T到异体CAR-T均是为了延长CAR-T细胞在体内的生存时间，诱导持久的完全反应。

最后，感谢所有参与CAR-T临床试验的患者及其亲属、朋友、志愿者，治疗的成功离不开所有人的信任、配合和坚持！同时感谢所有参与CAR-T临床试验的团队专家及成员，研究成果离不开你们的支持、指导和付出！